在發明蛋白質印跡法（Western Blot）出現了30多年之后，這項技術仍然是獲取特定蛋白可靠鑒定的關鍵。許多近期涌現的產品利用各種方法來提高蛋白質印跡實驗的可重復性、敏感性、定量性以及速度。

有三個人都被認為發展了蛋白質的免疫印跡方法，但其中只有一人才算得上是“Western Blotting（蛋白質印跡法）”的命名者，他就是當時在西雅圖哈欽森癌癥研究中心Bob Nowinski實驗室工作的W. Neal Burnette。“Western Blotting”的命名中暗含了Southern Blotting（Edwin Southern在1975年發明的一項技術，使用膠、尼龍膜和吸水紙去鑒定一個復雜個體中特定的DNA序列）、Northern Blotting（隨后發明出的相似策略，用于鑒定RNA）以及位于西海岸（West Coast）的Nowinski實驗室三者之意。

Burnette的技術成果直到1981年才得以發表。他回想起來，當時審稿人“特別”反對使用“Western blotting”這一名稱。但盡管如此，這個名稱還是沿襲了下來，而且蛋白質印跡技術也成為了zui廣泛使用的免疫化學技術之一。

工作原理

蛋白質印跡法的*步涉及到用凝膠電泳（Gelelectrophoresis）按照大小分離蛋白質，然后通過將膜置于膠上，將蛋白質轉移到膜上（通常是硝酸纖維素膜或聚偏二氟乙烯膜），并在膜上加上若干片吸水紙，然后將這套堆層放在緩沖溶液中，這樣就能通過毛細管作用將蛋白質向上拉拽到膜上。這也就是所謂的濕法或槽式轉印法。

另外兩項技術是干法和半干轉印法，這兩種方法比傳統的濕轉印法更快也更規整，但是對于高分子量蛋白質而言，效率更低。對于半干轉印方法來說，膜和膠放置在被緩沖液浸泡過的濾紙層之間，將這些都夾在陰極和陽極之間，電流就能驅動蛋白質轉移到膜上。三種方法中，干法轉印zui快，但轉印效率也zui低。

轉印結束后，膜被放在稀釋過的蛋白質溶液中用來封閉非特異性的蛋白質結合。然后將膜與一抗進行孵育、洗脫，再與標記了信號檢測探針的二抗進行孵育。

zui后一步是檢測，通常采用化學發光或者熒光方法。在化學發光檢測中，與酶交聯的二抗能夠與檢測抗原產生光發生反應，可以被膠片或成像裝置捕獲。而在熒光檢測中，抗體探針被熒光集團所標記。

熒光檢測方法的主要優勢在于，它可以同時檢測多個蛋白質，并且其信號更加一致。因此與化學發光檢測相比，也更有利于量化研究。

不少制造蛋白質印跡相關設備、軟件和消耗品的公司正在努力推動其中一些或所有步驟的自動化，期望能夠將這一實驗變得更加簡單有效。同時在實驗中加入了一些驗證點，讓研究人員能夠隨時監測實驗進展，甚至重新打造整個過程。科學家們尋求的是性、穩健性和策略化，從而能夠幫助他們避免浪費寶貴的造價高昂的抗體。

加速免疫檢測過程

轉印、抗體孵育、上樣和洗脫步驟占據了蛋白質印跡法實驗80%的時間，EMD Millipore公司“蛋白質印跡法解決方案”產品Michele Hatler這樣介紹。

這家總部位于加州泰梅庫拉的公司推出的SNAP i.d. 2.0蛋白質檢測系統加速了整個過程，使用真空裝置通過膜推入試劑，而不僅僅依賴于擴散作用。這樣就能將免疫檢測的時間從4小時縮短到30分鐘，Hatler表示。她解釋說：“我們真正致力于提高蛋白質印跡工作流程的效率。我們仍然是按照傳統的步驟走，只是加了一個真空裝置。”

Hatler指出，2.0版本是于2012年9月推出的，相比之前的版本有幾個方面的優勢。它可以使用中等大小的凝膠（8.5×13.5厘米）和迷你凝膠（7.5×8.4厘米），之前則只能用迷你凝膠。

“這一設備很便宜，操作也很簡便，但切實提高了實驗效率，節省了實驗時間。” Hatler說。

伯樂公司（Bio-Rad）的Trans-Blot Turbo蛋白質轉移系統是實驗臺面大小的儀器，能夠提供快速而的轉印。得益于新的轉印緩沖液配方，特殊的過濾材料和增強的電流強度（由一個集成電源調節），這一系統能夠在短至3分鐘的時間內完成轉印，并且印跡結果能與槽式轉移相媲美。傳統的半干轉移系統需要15到60分鐘時間，而且通常無法提供高分子量蛋白質轉移的有力結果。

增加驗證點以緩解憂慮

蛋白質印跡法的高失敗率常常令人感到非常沮喪，尤其是你需要若干天來換取一個結果。“這是一項非常不穩定的技術，”伯樂公司“蛋白質印跡組”市場Ryan Short說，“我們對用戶調查時發現，一半的用戶報告他們用此技術的失敗率至少是25%。”

Short還說：“幾乎沒有什么機會可以檢查實驗過程是否滿足期望。由此就產生了焦慮。我們正在引入可視驗證點的概念來增加信心和確定性。”

這家公司的標準和Mini-PROTEAN免染色預制膠，利用其ChemiDoc MP膠成像系統，使得研究者可以快速觀測到他們的蛋白是否正確地載入到凝膠上，進而確證高質量的蛋白質轉移，便于決定是否應該轉向下一個步流程或是重新開始。ChemiDoc MP系統是為化學發光和多元熒光斑點成像技術所設計，能夠在個人電腦上用ImageLab軟件來操作。

這些驗證點“真的很有用”，在實驗室使用該系統的加州大學戴維斯分校助理教授Aldrin Gomes表示：“我們可以成像這些免染的凝膠，不用加入額外的染料，而且能夠快速判斷跑在膠上的樣品是否出現問題。我們還能在蛋白質轉膜之后再去對凝膠成像，如果其中任何一個步驟出現問題，我們都可以在這一點上停止實驗進程。”

成像和軟件提高定量性

當許多科學家仍在使用膠片分析蛋白質印跡時，世面上開始出現越來越多的寬范圍免膠片凝膠記錄成像系統，這些系統可以用來成像并分析化學發光的印跡、熒光的印跡斑點或者同時檢測這兩種印跡。許多公司開始紛紛努力，爭相制造盡可能便捷的成像儀及其分析軟件。很多公司提供了按鍵式成像捕捉系統，其大小可在實驗臺上操作。

Syngene公司于2012年4月推出了非常簡潔的一鍵操作系統PXi，分析化學發光和熒光印跡。該系統是基于該公司的G:BOX成像系統，并配有GeneSys成像軟件。

2012年10月，賽默飛世爾公司（Thermo Fisher Scientific）推出了myECL成像儀，使用紫外和可見光透射法，專業的濾鏡和電荷耦合器件（CCD）攝影技術去捕獲和分析蛋白質印跡以及蛋白和核酸凝膠。

CCD照相機的靈敏度比X射線膠片高兩倍，據該公司介紹，該儀器的動態范圍高達10倍。用戶只需簡單地按下觸摸屏上其中一個*預設按鈕，無需調焦或調節照相機的設置。用戶也可以設置定制曝光，并可同時設置多達5個不同的曝光，或者使用預設的曝光參數。這臺成像儀占用的儀器空間很小，可以在實驗臺上使用。

Aplegen公司的Omega Lum G凝膠記錄系統也具有自動聚焦的特點，可以在實驗臺上操作，并配備了一臺整合的平板電腦。UVP公司在2012年1月推出了Chemi-Doc-It TS2成像儀，其特色在于整合的電腦和觸摸屏，允許用戶調節曝光、光圈、放大縮小和焦距等參數，當用戶按下實時預覽（Live Preview）按鈕時，還能提供圖像實例。

LI-COR公司的紅外成像系統版本是Odyssey CLx，該版本具有超過6對數的動態范圍，而前一個版本只具有超過4對數的動態范圍。當對蛋白質印跡結果進行解析時，這一增大的范圍能消除飽和度，提供了更寬的線性范圍可以轉換為定量數據。

“研究者在他們的印跡中不僅不會達到飽和，而且他們還可以將多重印跡結果放進成像儀中，根本無須擔心為這些印跡進行不同的設置調整。”位于林肯市的Nebraska公司產品市場Jeff Harford解釋說。

Rehana Leak是位于匹茲堡的美國迪尤肯大學（Duquesne University）的助理教授，她使用LI-COR的Odyssey CLx系統進行細胞如何適應低水平脅迫的研究。“Odyssey成像儀的優勢在于它是16位的成像儀，并且具有700和800納米兩個紅外波長，一次能夠成像兩個斑點。” Leak說，“這意味著我們可以一起檢測磷酸化和全部構象的蛋白。”兩個蛋白亞型通過其他方法很難進行同步區分，因為它們的基團非常相似。

Leak指出，Odyssey成像儀能夠可視化216個紅外線信號暗影，與之相比，X射線膠片只能灰度的呈現150個暗影。“這將從150個躍遷到65000個紅外暗影，因此這種方法可以獲取更高的分辨率。”她接著說，“這是不同尋常的定量化。”

2012年12月，LI-COR公布了一套新的數字成像系統，即C-DiGit系統，能夠用于化學發光印跡。該系統將于2013年推出。“就像zui近這些年數碼照相機取代膠片相機一樣，我們認為C-DiGit系統必將替代膠片化學發光。” LI-COR資深科學家Jon Anderson說，“這項技術能提供膠片用戶所習慣的所有靈敏度和圖像質量，同時顯著提升了數字圖像的質量。”

軟件始終保持直觀

傳統的軟件分析蛋白質印跡時需要用戶從圖像向電子表格導出數據，而后續的均一化計算和分析都由手動完成。BioRad于2012年9月發布的Image Lab 4.1軟件，針對看家蛋白或總上樣蛋白提供嵌入式、自動化的均一化。

“這是目前我在市面上見到的的產品之一。”Gomes說，他正在研究蛋白酶體和肌鈣蛋白在心臟和骨骼肌組織中的作用。“的一點是，它是*免費的。”Image Lab 4.1軟件比他之前在實驗室用過的圖像分析軟件都要簡便，Gomes接著說，幾乎每個人都能掌握。“這的確增強了我們定量蛋白質的方法。”

LI-COR公司也已經推出了新的成像軟件——Image Studio，能與其Odyssey系統一起使用。用戶只需選擇一個檢測通道，然后按一個按鈕就能獲得一張圖像。這個軟件的新版本提供毫米間隔的分析，而不是厘米間隔的，同時又能夠執行*的自動和手動分析。

重新打造蛋白質印跡

除了對傳統的蛋白質印跡技術進行微調，ProteinSimple公司的Simple Western系統對其進行了重新開發，用毛細管電泳使整個過程*自動化。在2011年，該公司推出了Simon，計劃使用該儀器全面取代蛋白質印跡法。Simon能夠基于大小進行分離、免疫檢測、洗滌、化學發光檢測和定量分析。科學家們僅需要加上樣品，然后離開，稍后回來就能得到*分析好的數據。Simon甚至能夠發出蜂鳴聲告知用戶結果出來了。

該公司緊接著在2012年初推出了Sally，該儀器允許用戶在一次實驗中進行96個Simple Western。而的設備則是2012年9月推出的Peggy，能夠一次分析96個樣品，并能按照尺寸或電荷分離蛋白。Simple Western克服了傳統蛋白質印跡法中手動部分的缺陷，比方說缺少重復性或定量化結果。此外，在傳統蛋白質印跡法中，多重檢測已經成為一種挑戰。研究者現在可以利用熒光去觀測一個樣品中的2個或3個蛋白質，轉移的設備可以一次同時跑8塊迷你膠或4塊中等大小的膠，但這已經是傳統蛋白質印跡法所能達到的極限。Simple Western能夠在每個毛細管中多重分析蛋白質，從而在本質上消除傳統蛋白質印跡法的限制。

對于斯坦福大學醫學院的腫瘤學教師Alice Fan來說，Simple Western技術zui令人興奮的事情在于它分析顯微級別樣品的能力。

Fan收集樣本組織樣本的時間已經超過10年，她一直在等待那個能夠讓她分析腫瘤細胞蛋白質組的工具，而且還無需用去整個樣品。“我找尋了多年，希望有一個設備能夠用極少量的組織進行蛋白質印跡。”她解釋說。

除了幫助她保存之前儲存的組織之外，Sally還讓Fan可以使用細針穿刺法多次從樣本身體中提取一些樣本，而不是做全面的活體檢視。Fan希望，這將能夠幫助她實時觀測樣本的腫瘤對藥物產生的反應。“在描述不同類型的腫瘤方面，這真的對我的研究大有裨益。這是巨大的進步。”

默克公司（Merck & Co）疫苗生物化學團隊負責人Richard Rustandi在2011年底購入了一臺Simon儀器。當時，他并沒有抱有很高的期待。但是，他說，他得到了意外的驚喜。“這臺儀器太棒了，我們在幾個月后又買了一臺。”

據Rustandi介紹，盡管Simon并不是無瑕的，但它能夠真正實現定量化。他接著說，手動的蛋白質印跡法通常具有35%到45%的變異率，但他和他的實驗室能夠將Simon的變異率控制在10%以下。

隨著蛋白質印跡技術地不斷演化，研究者zui終不用像保姆一樣，花費大量的時間照看著他們的實驗。“他們的時間非常重要。” Simple Western的產品Peter Fung認為，“你的時間利用率越高，就越能做出好的研究。”